家蚕磷酸吡哆醇氧化酶的体外定点突变及其活性鉴定

›› 2011, Vol. 54 ›› Issue (11): 1231-1235.doi:

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶的体外定点突变及其活性鉴定

童宁, 张剑韵, 黄龙全

收稿日期:2011-05-18 修回日期:2011-09-20 出版日期:2011-11-20 发布日期:2011-11-20
作者简介:童宁，女， 1985年生，安徽合肥人，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏工程， E-mail: tnl1225@126.com
基金资助:
国家自然科学基金项目（30870338）

Site-directed mutation of pyridoxine 5′-phosphate oxidase from Bombyx mori and activity assay of the mutants in vitro

TONG Ning, ZHANG Jian-Yun, HUANG Long-Quan

Received:2011-05-18 Revised:2011-09-20 Online:2011-11-20 Published:2011-11-20
About author:tnl1225@126.com

摘要/Abstract

摘要： 【目的】研究家蚕Bombyx mori磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine 5′-phosphate oxidase， PNPO）个别保守氨基酸残基对PNPO酶活性的影响。【方法】用重叠延伸法把氨基酸残基Lys¹¹¹（AAA）突变为Glu（GAA）， Ser¹⁶⁰（AGC）定点突变为Ala（GCC）；构建重组表达载体，在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达，经亲和纯化后进行酶活鉴定。【结果】重组蛋白的分子量约为45.0 kDa。体外酶活分析发现，家蚕氨基酸残基Lys¹¹¹突变体K111E活性降低了约78.0%， Ser¹⁶⁰突变体S160A的活性降低了67.4%。【结论】结果提示氨基酸残基Lys¹¹¹和Ser¹⁶⁰对维持家蚕PNPO的酶活性有重要作用。本研究明确了家蚕磷酸吡哆醇氧化酶个别保守氨基酸残基的酶学功能。

关键词: 家蚕, 磷酸吡哆醇氧化酶, 定点突变, 基因表达；蛋白纯化；酶活性

Abstract: 【Aim】 To study the effects of single conserved amino acid residue of pyridoxine 5′-phosphate oxidase (PNPO) from Bombyx mori on its activity. 【Methods】 Lys¹¹¹(AAA) and Ser¹⁶⁰(AGC), two of the most conserved residues, were mutated to Glu (GAA) and Ala (GCC) by using over-lap extension， respectively. The obtained expression plasmids were over-expressed in Escherichia coli Rosetta by IPTG induction, and then the expressed products were purified with affinity chromatography and the activity of the purified PNPO were determined. 【Results】 The molecular mass of the target recombinant protein was ~45.0 kDa. Compared with the wild type PNPO, the activities of the mutants K111E and S160A were reduced by 78.0% and 67.4%, respectively. 【Conclusion】 The results suggest that the residues Lys¹¹¹ and Ser¹⁶⁰ are important to maintain the activity of PNPO. This study confirms the significance of single conserved amino acid residues on the catalytic function of PNPO of B. mori.

Key words: Bombyx mori, pyridoxine 5′-phosphate oxidase, site-directed mutation, gene expression, protein purification, enzyme activity

童宁, 张剑韵, 黄龙全. 家蚕磷酸吡哆醇氧化酶的体外定点突变及其活性鉴定[J]. , 2011, 54(11): 1231-1235.

TONG Ning, ZHANG Jian-Yun, HUANG Long-Quan. Site-directed mutation of pyridoxine 5′-phosphate oxidase from Bombyx mori and activity assay of the mutants in vitro[J]. , 2011, 54(11): 1231-1235.

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