棉铃虫,几丁质,Ⅳ型几丁质酶,酶学性质,基因表达分析," /> 棉铃虫,几丁质,Ⅳ型几丁质酶,酶学性质,基因表达分析,"/>
昆虫学报 ›› 2019, Vol. 62 ›› Issue (2): 170-180.doi: 10.16380/j.kcxb.2019.02.004
麦麦提艾力·阿卜杜纳斯尔1, 马纪1, 刘宁2, 王威2, 李梦鸽1, 古新蓉1, 王新1, 刘小宁1,*
Gene cloning, characterization and expression profiling of a group Ⅳ chitinase from Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae)
Maimaitiaili ABUDUNASIER1, MA Ji1, LIU Ning2, WANG Wei2, LI Meng-Ge1, GU Xin-Rong1, WANG Xin1, LIU Xiao-Ning1,*
(1. Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China; 2.InstituteofCropVariety Resources,XinjiangAcademyof Agricultural Sciences,Urumqi830091,China)
摘要:
【目的】昆虫几丁质酶(chitinase, CHT)主要参与蜕皮、围食膜的降解和机体免疫防御等重要生理生长发育过程。本研究旨在对棉铃虫Helicoverpa armigera Ⅳ型(group)几丁质酶基因进行克隆和表达分析,为以该基因作为棉铃虫防控的分子靶标提供理论依据。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从棉铃虫中肠中克隆Ⅳ型几丁质酶基因,分别运用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和构建系统发育树。在大肠杆菌Escherichia coli(DE3)中诱导表达其体外重组蛋白,利用Western blot进一步验证;用Ni-NTA纯化柱纯化重组蛋白,之后研究该蛋白的酶学性质。qPCR分析该基因的在棉铃虫不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得棉铃虫几丁质酶基因HaCHT4(GenBank登录号: MH500771),其cDNA长1 624 bp,ORF长1 527 bp,编码509个氨基酸,预测的分子量为55.2 kD。蛋白质序列的N末端具有信号肽,中间序列部分含有一个催化结构域(catalytic domain, CAD), C末端含有一个几丁质结合结构域(chitin binding domain, CBD)。多序列比对显示,HaCHT4具有几丁质酶的保守区域;系统发育分析表明,HaCHT4属于Ⅳ型几丁质酶。重组蛋白His-HaCHT4在大肠杆菌中成功表达。纯化的重组蛋白对胶体几丁质底物具有降解活性,最适温度和pH分别为50℃和7,动力学参数Km和Vmax值分别为1.76±0.35 mg/mL和0.0220±0.0012 μg/mL·s。qPCR分析表明,HaCHT4在1龄和2龄幼虫期的表达量显著高于其他幼虫龄期及预蛹期;主要在中肠和脂肪体中高度表达,体壁和头部中低表达。【结论】结果提示棉铃虫HaCHT4可能参与围食膜中几丁质降解过程。这些结果为深入研究HaCHT4的功能奠定了基础,并为害虫防治提供了有用的信息。