意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

摘要/Abstract

摘要：

利用Bac to Bac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A₂（AmPLA₂）基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中，得到pBacHT-AmPLA₂，再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中，通过转座作用，得到含AmPLA₂基因的重组病毒rBacmid-AmPLA₂的DNA。提取其基因组DNA，用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4，得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA₂。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞, 在细胞中表达AmPLA₂。SDS-PAGE电泳结果显示，与6×His Tag融合表达的产物蛋白分子量约为18 kD左右，表达量约占细胞总蛋白的5.35%。Western blot印迹显示，融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA₂抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示，含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6.13 μmol·min^-1·mg^-1。

关键词: 意大利蜜蜂, 蜂毒, 磷脂酶A基因, 杆状病毒昆虫细胞系统, 表达

Abstract:

The cDNA encoding phospholipase A₂ of Apis mellifera (AmPLA₂) was cloned into a transfer vector pFastBacHTa to form the recombinant donor plasmid pBacHT-AmPLA₂. The recombinant donor plasmid was then transformed into Escherichia coli DH10Bac. By transposition, AmPLA₂ gene was integrated into Bacmid, and a recombinant shuttle vector, rBacmid-AmPLA₂ was constructed. The cultured Trichoplusia ni Tn-5B1-4 cells, mediated with Lipofectin, were transfected with the rBacmid-AmPLA₂ DNA, and then the recombinant baculovirus, rACV-Bac-AmPLA₂ was obtained. The recombinant virus was further used to infect the Tn-5B1-4 cells to express the target protein. SDS-PAGE analysis of the infected cellular proteins showed that the size of the expression product of AmPLA₂ fused with 6×His tag at its N-terminal was about 18 kD, and the expressed protein accumulated up to about 5.35% of the total cellular proteins. Western blot analysis using anti-AmPLA₂ polyclonal serum confirmed the expressed protein was a fusion protein of AmPLA₂. The protein extracts of AmPLA₂ showed an enzymatic activity of about 6.13 μmol·min^-1·mg^-1 for hydrolyzing egg yolk substrate.

Key words: Apis mellifera, bee venom, phospholipase A gene, baculovirus-insect cell system, expression

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意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A₂基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

Expression of phospholipase A₂ gene from the venom of Apis mellifera in the baculovirus-insect cell system

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