›› 2013, Vol. 56 ›› Issue (10): 1117-1126.doi:
沈杰, 刘振国, 沈芳, 吉挺*
SHEN Jie, LIU Zhen-Guo, SHEN Fang, JI Ting*
摘要: 【目的】本研究旨在克隆卡尼鄂拉蜂Apis mellifera carnica锌转运蛋白7相似蛋白(zinc transporter 7-like, ZnT-7-like)基因, 制备ZnT-7-like多克隆抗体, 了解该基因在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的差异表达情况。【方法】运用RTPCR法从卡尼鄂拉蜂王浆腺总RNA中扩增ZnT-7-like基因, 进行生物信息学分析, 为避开跨膜结构的干扰, 选择克隆其部分序列(273 bp)作为多肽免疫序列。将其亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)中诱导表达获得融合蛋白, 然后将融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 分别用间接ELISA和Western blot检测抗体的效价和特异性, 最后采用实时荧光定量RT-PCR以及Western blot技术检测该基因在不同日龄成虫王浆腺中的相对表达量。【结果】克隆得到卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 大小为1 065 bp。SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白成功表达; 制备的多克隆抗体效价高达1∶64 000, 且具有很高的特异性。ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂5个日龄成虫中的转录情况存在较大差异, 表现为3日龄成虫中的表达量极显著高于其他日龄(P<0.01), 12日龄表达量最低, 其他日龄间表达量两两差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01); ZnT-7-like蛋白表达与转录水平基本一致。【结论】成功克隆了卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 制备了兔抗蜂ZnT-7-like多克隆抗体, 并在转录和翻译两个水平上测定了ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的相对表达量。这些结果为深入研究卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因的功能奠定了基础。