【目的】本研究旨在系统鉴定和分析西方蜜蜂
Apis mellifera肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)相关基因及其剪接异构体,探析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征,并测定PGRP基因剪接异构体在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫
Nosema ceranae侵染中的表达模式,以期为西方蜜蜂PGRP基因剪接异构体的功能研究提供参考和依据。【方法】基于已获得的西方蜜蜂8和11日龄工蜂成虫中肠纳米孔测序数据,利用Blast工具将前期鉴定到的所有全长转录本分别比对到Nr和KEGG数据库,筛选出西方蜜蜂PGRP基因及其剪接异构体,并随机选择PGRP基因的5条剪接异构体通过RT-PCR验证序列的真实性。使用Gffcompare软件将鉴定到的PGRP基因序列比对至西方蜜蜂参考基因组以优化基因结构。采用Astalavista软件鉴定PGRP基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件类型,再通过RT-PCR和Sanger测序验证AS事件。利用相关软件预测和分析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫接种后西方蜜蜂工蜂成虫中肠中PGRP基因剪接异构体的相对表达量。【结果】共鉴定到西方蜜蜂的4个PGRP相关基因(
PGRP-3,
PGRP-S2,
PGRP-LC和
PGRP-LB)及其19条剪接异构体。通过RT-PCR与Sanger测序证实了PGRP基因5条剪接异构体(rna14029, ONT.6350.8, ONT.6350.10, rna24089和ONT.6350.7)的表达和序列真实性。
PGRP-3(gene10434)的5′和3′端分别延长了8和1 055 bp,
PGRP-S2(gene10435)的5′和3′端分别延长了27和234 bp。通过RT-PCR证实了
PGRP-S2的AS事件的真实性。剪接异构体ONT.6350.2编码蛋白的分子式为C
966H
1502N
272O
275S
7, 分子量约为21 527.63 D, 理论等电点为8.94, 平均亲水性为-0.119,含有信号肽和PGRP结构域,不含跨膜结构域;剪接异构体ONT.6350.6编码蛋白分子式为C
841H
1301N
243O
244S
5,分子量约为18 860.46 D,理论等电点9.14,平均亲水性为-0.324,不含跨膜结构域和信号肽。西方蜜蜂与东方蜜蜂
A. cerana的PGRP-S2在进化树上聚为一支。相较于未接种东方蜜蜂微孢子虫的对照组,接种东方蜜蜂微孢子虫的西方蜜蜂工蜂成虫中肠中剪接异构体ONT.6350.2的表达量在接种后2和4 d时显著上调,在接种后3 d时极显著上调;剪接异构体ONT.6350.6与ONT.6350.2的表达模式相同;剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在接种东方蜜蜂微孢子虫后1-4 d时总体上均表现为上升表达趋势。【结论】本研究优化了西方蜜蜂参考基因组上已注释的
PGRP-3和
PGRP-S2基因结构;揭示剪接异构体ONT.6350.2的编码蛋白可能是分泌蛋白,而剪接异构体ONT.6350.6的编码蛋白可能是胞内蛋白;西方蜜蜂与东方蜜蜂的
PGRP-S2同源性最高;剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫侵染中被激活表达。