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27.
梨小食心虫实时荧光定量PCR内
参基因的筛选
韩慧, 庞钦玮, 刘晓庆, 梁宝莲, 高玲玲, 马瑞燕, 郭艳琼
昆虫学报
2023, 66 (4):
450-458.
DOI: 10.16380/j.kcxb.2023.04.002
【目的】本研究旨在探明梨小食心虫
Grapholita molesta在不同发育阶段、成虫不同组织以及不同浓度的3种杀虫剂处理后成虫中稳定表达的内参基因,为后续对梨小食心虫目的基因表达的研究奠定基础。【方法】基于梨小食心虫转录组数据筛选10个候选内参基因(
β-actin, 18S rRNA, β-tubulin,
EF-1α, RPL13, RPL32, RSPL40, UBC7, α-tubulin和
RPS20);通过实时荧光定量PCR(qRTPCR)测定候选内参基因在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(头、前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、精巢和卵巢)以及不同浓度的3种杀虫剂(阿维菌素: 19.819, 72.897和179.663 μg/mL; 吡虫啉: 17.638, 163.323 和762.986 μg/mL以及高效氯氟氰菊酯:33.791, 96.123和198.282 μg/mL)通过玻璃管药膜法处理后成虫中的表达量;利用geNorm, NormFinder, ΔCt, BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价。选择梨小食心虫细胞色素P450基因
CYP354A32进行验证。【结果】结合qRT-PCR结果和软件评价结果表明,梨小食心虫不同发育阶段内参基因表达稳定性从高到低依次为
β-tubulin, 18S rRNA, EF-1α, RPL13, β-actin, RPS20, UBC7,
RPL32, α-tubulin和RSPL40;成虫不同组织内参基因表达稳定性从高到低依次为
UBC7, β-tubulin,
β-actin, 18S rRNA, RSPL40, EF1α, RPS20,
RPL13, RPL32和
α-tubulin;不同浓度阿维菌素、吡虫啉和高效氯氟氰菊酯处理后成虫中内参基因表达稳定性从高到低依次为
RPS20,
RPL13,
β-tubulin, β-actin, RPL32, RSPL40, EF-1α, UBC7, α-tubulin和1
8S rRNA。用所获得的内参基因组合对
CYP354A2表达特性进行的分析结果表明,用
β-tubulin, 18S rRNA和
EF-1α组合作为内参基因时
CYP354A2在高龄幼虫及成虫中表达量较高,用
UBC7, β-tubulin和
β-actin组合作为内参基因时在成虫精巢和卵巢中有较高表达,且用
RPS20,
RPL13和
β-tubulin组合作为内参基因时不同浓度杀虫剂处理后仅有19.819 μg/mL阿维菌素处理时
CYP354A2表达量高于对照,其余浓度杀虫剂处理时
CYP354A2表达量均低于对照。【结论】梨小食心虫不同发育阶段目的基因表达的研究推荐使用β-tubulin, 18S rRNA和
EF-1α组合作为内参基因;梨小食心虫成虫不同组织目的基因表达的研究推荐使用
UBC7,
β-tubulin和
β-actin组合作为内参基因;不同浓度阿维菌素、吡虫啉和高效氯氟氰菊酯处理梨小食心虫成虫后目的基因表达的研究推荐使用
RPS20,
RPL13和
β-tubulin组合作为内参基因。
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