【目的】氨肽酶N(aminopeptidase N, APN)是昆虫消化系统中重要的蛋白酶。本研究旨在对在褐飞虱Nilaparvata lugens中肠中两个具有较高转录水平的apn基因(nlapn1和nlapn4)在中肠上皮细胞上的表达及其蛋白功能特性进行鉴定与分析。【方法】利用最大似然法进行褐飞虱NLAPN1和NLAPN4的系统进化分析；利用Western blot分析NLAPN1及NLAPN4在中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles, BBMVs)中的定位；利用LC-ESI-MS/MS技术对Western blot定位的NLAPN1及NLAPN4进行鉴定。在果蝇Drosophila S2细胞内分别表达两个NLAPN蛋白，并利用Western blot及免疫荧光定位技术对NLAPN1与NLAPN4进行S2细胞内的定位；分别以L-亮氨酸对硝基苯胺(leucine-p-NA)、L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Ala-p-NA)、L-甲硫氨酸对硝基苯胺盐酸盐(Met-p-NA)和L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐(Lys-p-NA)为底物测定NLAPN1和NLAPN4的酶活性。【结果】系统进化树分析结果显示，褐飞虱NLAPN1及NLAPN4与其他半翅目昆虫肠道中高表达的APN分在了同一分支中。Western blot及LC-ESI-MS/MS质谱分析结果证明NLAPN1与NLAPN4均存在于褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡中，分子量约为160 kD。Western blot及免疫荧光定位结果显示，两个NLAPN蛋白均位于S2细胞膜上，而C端缺失糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定位点的NLAPN4lackG蛋白分布在细胞质中。酶活性测定结果显示,以L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐及L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐为底物时NLAPN1和NLAPN4都具有一定的酶活性，而以L-亮氨酸对硝基苯胺为底物时NLAPN1有极高的酶活性(＞60 U/mg)。【结论】NLAPN1与NLAPN4是褐飞虱中肠上皮细胞膜上高表达的两个膜结合APN蛋白，且都通过C端的GPI锚定附着在细胞膜上。NLAPN1与NLAPN4与鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫中肠膜结合APN有着近似的蛋白结构与酶学特性。膜结合APN在褐飞虱中肠中的生理生化功能及其与外源病原物的互作机制还有待进一步深入研究。

 【目的】本研究旨在通过研究小菜蛾Plutella xylostella溶菌酶的功能，进一步认识小菜蛾的免疫防御机理，为小菜蛾的生物防治提供新的思路。【方法】利用RACE技术克隆小菜蛾溶菌酶基因。构建原核表达载体pET-29a-Pxlys，利用原核表达系统表达并用镍柱亲和层析纯化重组蛋白Pxlys。利用牛津杯法检测重组蛋白Pxlys对停滞棒杆菌Corynebacterium stationis、藤黄微球菌Micrococcus luteus、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、志贺氏菌Shigella sp.、沙门氏菌Salmonella sp.和苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis的抑菌活性，并利用扫描电子显微镜观察重组蛋白Pxlys对停滞棒杆菌和大肠杆菌的溶菌特征。【结果】克隆获得开放阅读框长423 bp的小菜蛾溶菌酶基因Pxlys(GenBank登录号： MN702780)序列，它编码140个氨基酸，相对分子质量为15.79 kD。抑菌试验表明，重组蛋白Pxlys不仅对革兰氏阳性细菌的停滞棒杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性(抑菌圈直径分别为20.0±1.1, 19.0±0.5和16.5±0.5 mm)，而且对革兰氏阴性细菌大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌也有抑菌活性(抑菌圈直径分别为16.3±0.5, 15.0±0.5和14.0±1.1 mm)，重组蛋白Pxlys对革兰氏阳性细菌比对革兰氏阴性细菌表现出更强的抑菌活性。另外，重组蛋白Pxlys还表现出对苏云金芽胞杆菌的抑菌活性。扫描电子显微镜下，经重组蛋白Pxlys处理过的停滞棒杆菌和大肠杆菌的溶菌特征不同。【结论】Pxlys具有广谱的抗微生物活性，其对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的抑菌机理可能存在不同。研究结果为深入研究小菜蛾免疫防御系统提供基础。

 【目的】探究热激蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因在美国白蛾Hyphantria cunea抵御高温胁迫过程中的作用，为揭示美国白蛾的扩散机制以及预测潜在分布区提供理论支撑。【方法】利用PCR技术克隆美国白蛾HSP70基因，并进行生物信息学分析；利用qPCR技术检测新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在25, 30, 35和40℃处理下HSP70基因的表达特性；构建美国白蛾HSP70的原核表达载体，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中诱导表达该蛋白，利用Ni²⁺-His柱纯化蛋白，并通过Western blot验证该蛋白；利用体外实验测定原核表达获得的重组蛋白在高温胁迫下的ATP酶活性。【结果】克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70(GenBank登录号: MT995848)和HcHSC70(GenBank登录号: MT261583)，其ORF长度分别为1 917和2 061 bp，分别编码637和687个氨基酸，分子质量分别约为69.66和74.96 kD，等电点分别为5.90和5.96；氨基酸序列结构均含有3个高度保守的区域GIDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和VGGSTRIPKVQ，符合热激蛋白70家族的特征；蛋白三维结构均由N端ATPase功能域和C端底物结合功能域所组成。系统进化树显示HcHSP70与鳞翅目HSP70家族其他成员聚为一支，而HcHSC70与鳞翅目HSC70家族的其他成员聚为另一支。qPCR结果表明，新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在热胁迫下HcHSP70的相对表达量显著上调，且在35℃处理2 h下达到峰值，而热胁迫下HcHSC70的表达响应较微弱。成功构建了HcHSP70的原核表达载体并在体外诱导表达。纯化后的重组蛋白HcHSP70具备ATPase活性，且在高温胁迫下酶活性稳定。【结论】本研究克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70和HcHSC70，明确了两条基因在高温处理下的表达特性；成功对美国白蛾HcHSP70进行原核表达及纯化，并证明重组蛋白HcHSP70在高温下具有稳定的ATPase活性，推测其在美国白蛾应对高温胁迫中发挥着重要作用。

【目的】本研究旨在明确甜菜夜蛾Spodoptera exigua半胱天冬酶(caspase)在细胞凋亡诱导剂诱导和病原微生物胁迫下的表达模式，为丰富鳞翅目昆虫细胞凋亡机制研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR技术从甜菜夜蛾3龄幼虫体内扩增两个半胱天冬酶基因(SeCasp-3和SeCasp-4)编码区的全长；利用qPCR技术分别检测两个半胱天冬酶基因在细胞凋亡诱导剂过氧化氢(hydrogen peroxide, H₂O₂)(100 μmol/L)、放线菌素D(actinomycin D, ActD)(10 μg/mL)和地塞米松(dexamethasone, DEX)(50 μg/mL)诱导后甜菜夜蛾脂肪体细胞中及病原菌苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis kurstaki (Btk)(10⁸个细菌/mL)、大肠杆菌TG1菌株Escherichia coli TG1 (E. coli TG1)(10⁸个细菌/mL)、烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothis virescens ascovirus 3h, HvAV-3h)(1.16×10¹¹个基因组拷贝/mL)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)(5 000 OBs/μL)感染后甜菜夜蛾3龄幼虫体内的表达模式。【结果】SeCasp-3(GenBank登录号: MW183334)的编码区长942 bp，共编码313个氨基酸；SeCasp-4(GenBank登录号: MW183335)的编码区长843 bp，共编码280个氨基酸。SeCasp-3和SeCasp-4的假定蛋白序列与家蚕Bombyx mori Dronc的氨基酸序列一致性分别为45.54％和58.46％，且SeCasp-3和SeCasp-4之间具有较高的同源性。SeCasp-3和SeCasp-4在不同化学物质诱导下的甜菜夜蛾脂肪体细胞中的表达模式存在明显差异，在100 μmol/L H₂O₂和10 μg/mL ActD处理后24和48 h，脂肪体细胞中SeCasp-3和SeCasp-4的相对表达量均显著升高；50 μg/mL DEX处理后24和48 h，SeCasp-3的相对表达量未见显著变化，但SeCasp-4的相对表达量升高了数千倍。在不同病原微生物感染后的甜菜夜蛾3龄幼虫体内，SeCasp-3和SeCasp-4的表达模式基本相同。一般线性模型的分析结果表明，Btk和E. coli TG1的感染不造成SeCasp-3和SeCasp-4相对表达量的显著变化，而HvAV-3h和AcMNPV的感染则显著抑制了这两个基因的表达。【结论】本研究鉴定了两个甜菜夜蛾半胱天冬酶基因，并分析了其对细胞凋亡诱导剂和病原微生物感染的表达响应，为进一步探究半胱天冬酶功能和昆虫细胞凋亡过程提供了重要的理论基础。

 【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1 (Wingless)，人工合成特异性siRNA，向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ERFA-RNAi)，以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组(negative control, NC)，解剖5龄幼虫斑纹区的表皮，用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量，验证电穿孔介导的RNAi效果。带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR，通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫；正常饲养72 h后，用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达，验证当世代家蚕的嵌合体转基因。【结果】家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后，5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制，实时定量RTPCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低。嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60%，并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达。【结论】电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA，是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法。

 【目的】分析吡虫啉处理对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica嗅觉学习行为及脑部基因转录的影响，为新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的负面影响提供依据。【方法】实验室条件下一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含有4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液，以饲喂不含吡虫啉的50%蔗糖溶液为对照，通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)行为实验测定其对意大利蜜蜂成年工蜂嗅觉学习行为的影响；收集上述测试的意大利蜜蜂工蜂脑部提取RNA，进行RNA-Seq测序和生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR挑选6个差异表达基因(DEGs)检测其在脑部的表达量以验证RNA-Seq测序结果。【结果】一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液后，意大利蜜蜂的嗅觉学习能力与对照组(饲喂50%蔗糖溶液)相比显著降低。RNA-Seq测序结果显示饲喂意大利蜜蜂含4 ng吡虫啉蔗糖溶液后，处理组与对照组之间共有123个DEGs［校正后的P值(padj)<0.05)］，包括82个下调DEGs和41个上调DEGs。GO聚类分析发现下调DEGs主要富集在S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性、酸性磷酸酶活性、氧化还原酶活性、蛋白质异二聚化活性等，上调DEGs主要富集在跨膜受体活性、分子传感器活性、神经学系统过程等功能条目。KEGG富集分析显示下调DEGs主要富集在核糖体和溶酶体等细胞器、碳代谢和色氨酸代谢等代谢通路及Toll和Imd信号通路，上调DEGs未富集在KEGG代谢通路。荧光定量PCR结果显示测试的6个DEGs相对表达量变化趋势与RNA-Seq测序结果FPKM(fragments per kilobase million)值变化趋势一致，证明RNA-Seq测序结果可靠。【结论】亚致死剂量吡虫啉胁迫意大利蜜蜂成年工蜂显著降低意大利蜜蜂的嗅觉学习能力，影响意大利蜜蜂脑部免疫解毒等相关基因的表达和酶活性及氧化还原等生物代谢过程；亚致死剂量吡虫啉短时胁迫会刺激意大利蜜蜂的嗅觉感觉过程及神经信号传导过程。

【目的】结合四臂嗅觉仪与轨迹跟踪分析系统，通过分析不同试验条件下黑腹果蝇Drosophila melanogaster的嗅觉行为，建立适合于果蝇等小型昆虫的嗅觉行为实验技术体系。【方法】采用Ethovision XT软件追踪黑腹果蝇在四臂嗅觉仪内的活动轨迹，分析各区域内的累计停留时长、运动速度；同时，考察气流速度和味源设置对苹果醋引诱及蓝桉Eucalyptus globulus叶油驱避黑腹果蝇效果的影响。【结果】适合于黑腹果蝇嗅觉行为分析的气流速度为300~1 200 mL/min；300 mL/min时黑腹果蝇个体间运动速度最为均一，因此推荐最适气流速度大小为300 mL/min。味源设置不会改变黑腹果蝇对味源物的嗅觉行为反应，但对味源物的引诱指数有一定的影响，单一臂放置味源物试验效果更佳。单头测试的实验效果优于多头试验。【结论】本研究建立的基于轨迹跟踪的嗅觉行为分析体系可用于昆虫信息化合物有效成分的筛选鉴定。在合适的气流条件下，单一臂设置味源化合物逐头进行测试试验效果更佳；多头试验可用于化合物的初步筛选。

【目的】拟步甲对维持荒漠半荒漠生境的生物多样性和生态系统功能具有重要作用。本研究旨在揭示拟步甲物种的生态位及种间关联，为冲积扇荒漠草地生境拟步甲群落构建机制研究奠定基础。【方法】2019年5-10月采用陷阱法调查贺兰山冲积扇荒漠草地划分为100个相同大小正方形单元的200 m×200 m样地的拟步甲昆虫群落组成，运用2×2联列表分析、生态位宽度、生态位重叠、方差比率法、 χ²检验、联结系数(AC)、共同出现百分率(PC)、Ochiai指数、Dice指数和Spearman秩相关系数等方法分析物种间的生态位和种间联结性。【结果】6次调查共捕获拟步甲科成虫7属10种1 086头，其中克小鳖甲Microdera kraatzi kraatzi、弯胫东鳖甲Anatolica pandaroides和平坦东鳖甲Anatolica planata是优势种。平坦东鳖甲空间生态位宽度最大，小圆鳖甲Scytosoma pygmaeum时间生态位宽度最大，克小鳖甲时空生态位宽度最大，类沙土甲Opatrum subaratum时间、空间、时空生态位宽度最小，处于竞争劣势。对拟步甲生态位宽度值聚类表明，克小鳖甲、弯胫东鳖甲、小圆鳖甲和裂缘圆鳖甲S. dissilimarginis是广生态位种。种对的时间生态位重叠比空间生态位重叠更显著。方差比率和W检验表明拟步甲昆虫总体呈显著正关联； χ²检验、联结系数(AC)和Spearman 秩相关系数的结果显示正负关联种对的比率大于1，总体趋于正相关。共同出现百分率(PC)、Ochiai指数和Dice指数表明，优势种克小鳖甲、弯胫东鳖甲和平坦东鳖甲种间呈显著正关联。根据Spearman秩相关系数结果，这10种拟步甲可划分为3个生态种组。【结论】优势种类具有较宽的生态位，物种时间生态位和空间生态位宽度变化不一致，正联结性显著的种对生态位重叠相应也较高。生态种组聚类反映了种对生态适应性的差异。研究结果为研究冲积扇荒漠草地生境小尺度空间拟步甲昆虫群落演替提供了参考依据。

【目的】蟋螽是直翅目中唯一具有吐丝筑巢行为的类群。本研究旨在探讨蟋螽丝腺的结构特点。【方法】应用解剖学观察、免疫荧光、苏木精-伊红染色、PAS苏木精染色、扫描电镜和透射电镜等方法从细胞水平对黑缘烟蟋螽Capnogryllacris nigromarginata丝腺的显微与超微结构进行了观察。【结果】黑缘烟蟋螽丝腺由导管和腺泡构成。腺泡由鞘细胞延伸形成的结缔组织鞘包围。腺泡的主体有4种细胞，分别为Ⅰ型分泌细胞、Ⅱ型分泌细胞、围细胞和腔细胞。Ⅰ型和Ⅱ型分泌细胞为大的腺细胞，形状不规则。分泌细胞细胞核很大，胞质内有大量的内质网和分泌颗粒。Ⅰ型分泌细胞靠近腺泡中心，PAS-苏木精染色表明Ⅰ型分泌细胞内含糖蛋白，Ⅱ型分泌细胞在腺泡外周，位于Ⅰ型分泌细胞与围细胞或结缔组织鞘之间。腔细胞分散在分泌细胞之间，包围形成胞外运输分泌物的通道。围细胞与鞘细胞接触，具有由细胞膜内陷形成的微绒毛腔，胞质内有大量的线粒体。围细胞微绒毛腔与腔细胞包围的细胞外运输通道相连，分泌细胞分泌的颗粒聚集在分泌细胞和胞外运输通道之间的连接处，并将分泌物排出至胞外运输通道。多个腺泡的胞外运输通道汇集到由单层细胞组成的丝腺导管。单层导管细胞靠近管腔外围具有规则排列的质膜内陷和大量伸长的线粒体；靠近管腔的一侧具连续的细胞膜突起，在导管壁的表皮下紧密排列。【结论】黑缘烟蟋螽丝腺分泌细胞分为Ⅰ型分泌细胞和Ⅱ型分泌细胞。分泌物质产生及分泌过程依次经过分泌细胞、腔细胞包围的胞外通道、分支导管、总导管和唾窦。其中在腺泡细胞之间，分泌物向外运输过程中，围细胞微绒毛腔的微丝束可能对分泌物的外排提供推动力。

昆虫只有一个或两个电压门控钠离子通道α亚基基因，但两种转录后修饰(选择性剪切和RNA编辑)实现了昆虫钠离子通道的功能多样性。昆虫β辅助亚基TipE和TEH1-4在钠离子通道表达和调控中也起着重要作用。电压门控钠离子通道在动作电位的产生和传递中至关重要，是多种天然和人工合成神经毒素及杀虫剂的作用靶标，包括广泛使用的拟除虫菊酯类、茚虫威和氰氟虫腙等杀虫剂。其中，拟除虫菊酯类杀虫剂通过调控昆虫钠离子通道的失活和去激活，延长跨膜钠离子流的时间，引起神经兴奋性传导障碍；茚虫威和氰氟虫腙阻断昆虫中枢和外周神经系统神经元的动作电位传导，这些神经毒剂都能干扰昆虫钠离子通道的正常功能。昆虫钠离子通道一般存在两个拟除虫菊酯类杀虫剂结合位点，但不同物种钠离子通道与拟除虫菊酯的结合位点存在一定差异。据此，本文就昆虫钠离子通道及其与杀虫剂的相互作用加以综述，有望推动昆虫神经受体研究，且对鉴定昆虫抗药性相关突变位点和研发高效的杀虫剂均具有重要参考价值。

 蚂蚁(蚁科)有显著的群居特性，个体间分工明确，并具有复杂的合作策略，以保护巢穴不受捕食者、病原微生物、蚂蚁竞争者的侵害，以及捕食猎物等。切叶蚁亚科是蚁科的最大类群，共有147个现生属，主要通过喷洒富含生物碱的毒液分泌物进行防御和捕猎。本文综述了该亚科防御性生物碱的组分及属种分布特征，其结构类型包括哌啶、吡啶、吡咯、吲哚里西啶、吡咯里西啶和脂肪胺等，并对其功能及应用进行了概述和展望。哌啶类生物碱是火蚁属Solenopsis毒液的典型特征，而吡咯烷、吡咯啉和吡咯里西啶类生物碱是小家蚁属Monomorium毒液的主要成分。吲哚里西啶类生物碱是脊红蚁属Myrmicaria蚂蚁和火蚁属贼蚁毒液的主要成分。除此之外，脂肪胺也是小家蚁属蚂蚁的毒液成分。这些毒液生物碱成分具有显著的生物活性，在农药和生物医药领域具有重要的应用前景。